新開(kāi)發(fā)的療法，如干細(xì)胞療法，正在將醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從治療癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)橹斡膊?。人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)以其分化為不同細(xì)胞類型和組織的能力改變了再生醫(yī)學(xué)。雖然人類iPSCs已經(jīng)用于自體治療，但下一個(gè)突破將是開(kāi)發(fā)經(jīng)認(rèn)證的iPSCs用于現(xiàn)成的治療。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，可以通過(guò)人類白細(xì)胞抗原(HLA)消耗來(lái)降低異種iPSCs的免疫原性，從而建立GMP級(jí)的主細(xì)胞庫(kù)，用于細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)降低同種異體療法的制造成本[1]。
開(kāi)發(fā)基因工程的iPSCs需要在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行幾輪克隆篩選，傳統(tǒng)的有限稀釋法分離單細(xì)胞耗時(shí)長(zhǎng)，熒光標(biāo)記分選影響高度敏感的iPSCs的存活率，并且有污染的風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，CYTENA的克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)利用透明微流控芯片和實(shí)時(shí)成像技術(shù)、算法，以高活力和高效率將單細(xì)胞分選和分配到96/384孔板內(nèi)。
近年來(lái)，利用此設(shè)備分離iPSCs的方法已被報(bào)道[2-4]。在這里，展示了使用UP.SIGHT在不損失多能性的情況下，對(duì)人類iPSCs溫和分離單細(xì)胞克隆在技術(shù)上是可行的，在方法優(yōu)化后的單克隆回收率高達(dá)80%。
材料與方法
來(lái)源于人成纖維細(xì)胞的對(duì)照iPSCs在無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中，用TeSR E8培養(yǎng)基培養(yǎng)[5]。細(xì)胞匯合度到70%的時(shí)候，按1:3 ~ 1:6比例稀釋傳代。用于單細(xì)胞分選的細(xì)胞也在60- 70%的匯合度下進(jìn)行收獲，確保細(xì)胞看起來(lái)健康且未分化的狀態(tài),并以0.5-0.8x10 6個(gè)細(xì)胞/ mL的濃度在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸為單細(xì)胞懸液。將80 uL的單細(xì)胞懸液裝入芯片(EASY.ON cartridge)并安裝在UP.SIGHT上進(jìn)行單細(xì)胞分選。單細(xì)胞重懸液和孔板中的克隆培養(yǎng)基中都含有ROCK抑制劑，單細(xì)胞分選于裝有克隆培養(yǎng)基的96孔板上，分選完的板子盡快轉(zhuǎn)回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在前7天用UP.SIGHT監(jiān)測(cè)iPSCs的單克隆生長(zhǎng)。
結(jié)果與討論
對(duì)照組采用手動(dòng)有限制稀釋法，濃度為0.5個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板 [6-7]，10天后達(dá)到了預(yù)期的10-20%的克隆率(數(shù)據(jù)未顯示)。使用UP.SIGHT進(jìn)行的第一次分選實(shí)驗(yàn)在相同的條件下獲得了6%的克隆率(圖1 A)。以這些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為基準(zhǔn)，通過(guò)系統(tǒng)的逐步優(yōu)化條件來(lái)逐漸提高回收率。
首先，我們優(yōu)化了裝載在UP.SIGHT墨盒上的細(xì)胞重懸液。確定與使用原始基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，使用鹽水緩沖液后近乎使克隆恢復(fù)提高一倍(圖1 B)。其次，由于iPSCs通常需要定期更換培養(yǎng)基，這種在早期更換培養(yǎng)基的操作對(duì)脆弱敏感的iPSCs的生長(zhǎng)是有不利的，我們測(cè)試了在分選后的前7天中通過(guò)添加補(bǔ)充制劑到培養(yǎng)基中來(lái)避免更換培養(yǎng)基組份的效果。用補(bǔ)充制劑A(圖1 C)和不同濃度的補(bǔ)充制劑B(圖1 D和E)添加到克隆培養(yǎng)基，均可以獲得更高的單克隆率，其中補(bǔ)充制劑B可提高到50%。
圖1：優(yōu)化分選提高克隆回收率
A:初始重懸細(xì)胞液條件，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件最相似。B:鹽溶液作為重懸液。C:添加了補(bǔ)充制劑A的克隆培養(yǎng)基. D-E:添了不同濃度補(bǔ)充制劑B的克隆培養(yǎng)基. F:克隆培養(yǎng)基改為添加了補(bǔ)充制劑B的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基?？寺』謴?fù)值以第7-10天克隆生長(zhǎng)孔的百分比表示。
添加劑能夠保持分選后的培養(yǎng)板細(xì)胞在前7天不受干擾，顯著提高了克隆率。在7天后，我們獲得了更大尺寸和良好形態(tài)的克隆團(tuán)(圖2)。最后，我們替換了克隆板中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，并使用優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行iPSCs的單細(xì)胞接種，優(yōu)化條件包括鹽溶液重懸樣品，加上適合目的的克隆培養(yǎng)基，并以優(yōu)化濃度的培養(yǎng)基補(bǔ)充物等，從而獲得高達(dá)80%的單克隆率(圖1 F)和長(zhǎng)勢(shì)良好的克隆團(tuán)(圖2)。
(值得一提的是：此次實(shí)驗(yàn)還測(cè)試了其他沒(méi)有顯著影響克隆恢復(fù)的參數(shù)。如，不同的ROCK抑制劑配方、板涂層和板類型。但不能認(rèn)為這些變量在其他實(shí)驗(yàn)條件下使用時(shí)不會(huì)對(duì)克隆恢復(fù)產(chǎn)生影響。)
圖2：克隆生長(zhǎng)與形態(tài)
使用UP.SIGHT分選單細(xì)胞到96孔板中，并在第7天進(jìn)行板底成像。
本實(shí)驗(yàn)中對(duì)UP.SIGHT板成像能力也進(jìn)行了測(cè)試。從圖中能夠確認(rèn)圖像質(zhì)量足夠好，可以評(píng)估克隆的形態(tài)，以確定細(xì)胞在單細(xì)胞分選后是否保持其典型的iPSCs形態(tài)(圖2)。
圖3：用UP.SIGHT進(jìn)行克隆生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)
此外，UP.SIGHT上的成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)顯微鏡相比具有更快的優(yōu)勢(shì):整個(gè)孔板(96/384孔板)的圖像采集不到6分鐘，大大減少了孔板在培養(yǎng)箱外的停留時(shí)間，尤其是384孔板。當(dāng)在全孔板上進(jìn)行初始篩選時(shí)，這一點(diǎn)特別重要，可以在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)快速進(jìn)行成像(圖3)。
結(jié)論
本研究表明，使用UP.SIGHT分選iPSCs可獲得良好形態(tài)的克隆團(tuán)，具有較高的克隆恢復(fù)率。為了更大化克隆恢復(fù)，可通過(guò)優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞在分選前收獲時(shí)的活率和生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞懸液、克隆培養(yǎng)基及補(bǔ)充物，以確保細(xì)胞在分選后的第一天盡可能不受干擾；UP.SIGHT的快速平板成像功能可實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)克隆的形態(tài)監(jiān)控和快速篩選。
總之，UP.SIGHT是一種多用途儀器，可實(shí)現(xiàn)高效、高質(zhì)量和節(jié)省時(shí)間的iPSCs分選和早期監(jiān)測(cè)，以選擇正確優(yōu)質(zhì)的單克隆。
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